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Bethesda的共识，把慢性粒细胞白血病（CML）列为流式细胞术不适合诊断的病种之一，临床上做流式的时候，也常常被慢性粒细胞白血病的诊断所困扰，尽管嗜碱粒细胞增高、粒细胞分化异常可辅助，但毕竟不一定特异，更有甚者，很多临床医生习惯了AML、ALL的流式MRD检测，还经常会送CML的MRD过来，是不是傻眼了？

记得若干年前，BD曾经出过一个蛮吸引人的BCR-ABL融合蛋白定量检测试剂盒，利用的是CBA原理，大致原理应该如下：

但这个方法需要将细胞裂解掉，获取其中的蛋白质，对于流式来说，并没有发挥流式细胞分群的优势。

尽管目前RQ-PCR已经成为CML诊断和治疗效果监测的金标准，但是基因毕竟是基因，是否会转录－翻译成蛋白质，不得而知，所以如果能从蛋白质层面进行检测，并且能够与特定细胞关联，那肯定是极好的，这只有流式可以做的到。

Liza等人在年3月份的ScientificReports上发表了《FlowCytometricMeasurementofBloodCellswithBCR-ABL1FusionProteininChronicMyeloidLeukemia.》，介绍了PLA-flow（全称是insituproximityligationassaywithflowcytometry，就是原位近端连接流式检测）检测BCR-ABL1融合蛋白。我觉得极具参考意义。

做技术的，就直接进入技术吧。

PLA流式的检测原理图。采用一对寡聚体结合的抗体（PLA探针），对固定和透化细胞中的融合蛋白的BCR和ABL1结构域具有亲和力（A）。PLA探针上的寡核苷酸，可作为两个另外的DNA寡核苷酸杂交的模板，引导其连接成DNA圈（B）。连接后，通过滚环扩增（RCA）局部扩增DNA环，最后通过加入互补荧光团标记的寡核苷酸（C）可视化和检测的RCA产物，然后通过流式细胞术检测标记的细胞。

1、新鲜收集的全血或骨髓裂解红细胞后，以PBS洗涤，去上清。

2、采用的抗体：

针对BCR蛋白N末端Lys-Asp的多克隆绵羊IgG抗人BCR抗体

针对ABL蛋白C末端Ala-Val的多克隆山羊IgG-抗人ABL抗体

这两个结构存在于融合蛋白的所有变体中。抗体均来自RDSystems。

末端结合上寡核苷酸，但是文中未写到怎么连接，有点奇怪！！

3、若需与CD34共染，可加入CD34单抗（文中采用PB标记的CD34），室温避光孵育30分钟后，加入1％多聚甲醛固定10分钟。

4、取5×10E6细胞，ul阻断缓冲液（blockingbuffer）在37度阻断45分钟，离心去上清。

5、第2步中所述的PLA探针以1：50稀释在DuolinkInSituantibodydilutionmix(Sigma-Aldrich)，与细胞37度孵育90分钟，也可以4度孵育过夜。

6、用含0.05％Tween20的1×Tris-bufferedsaline（TBST）洗涤细胞。

7、将细胞与含nM环化寡核苷酸的连接缓冲液在37度作用30分钟，使抗体末端连接上环化寡核苷酸。

连接缓冲液配方：10mMTris乙酸盐、10mM乙酸镁、50mM乙酸钾、12.5mMNaCl（pH7.5）、0.μg/μl的BSA、0.％Tween20、0.5mMATP、0.02U/μlT4DNA连接酶

8、TBST洗涤一次。加入环化试剂：0.5?U/μlphi-29DNApolymerase(Fermentas)、RCAbuffer(2xphi-29DNApolymerase-buffer,pH7.5）(Fermentas)、0.25?μg/μlBSA、0.5?mMdNTP。37度孵育90分钟。

9、TBST洗涤一次。与10?nMBodipyTR-fluorophore-coupledoligonucleotidesinhybridizationbuffer(20?mMTris-hydrochloride,20?mMEDTA,1%Tween20,1?MNaCl)于37月孵育15分钟。

10、TBST洗涤一次，用PBS重悬，上机检测。

4个字，非常漂亮。

上图是细胞株和病人标本的BCR-ABL1融合蛋白PLA-flow检测结果，A－D是荧光显微镜检测，A是K作为阳性对照，B是U作为阴性对照，C是CML患者，D是健康人。E则是U的流式检测结果，完全阴性。F则是K流式检测结果，完全阳性。

CML患者和正常对照的BCR-ABL1阳性细胞的PLA-flow检测结果。顶部一行5个图是初诊患者的PLAflow的分析实例，而中间行代表先前治疗或正在治疗的患者。在采集样品时，7号和9号患者正在接受伊马替尼治疗，10号患者未接受任何治疗，14号和17号接受达沙替尼治疗。底部这行3个样本是阴性对照，两个来自健康人，一个来自不添加PLA探针的患者样本。第一行和第二行同时显示了RQ-PCR检测BCR-ABL1转录水平的结果。

整体看下来，步骤时间还是有点长，但是如果做成成品，我觉得还是挺有吸引力的，毕竟，流式可以结合更多的标记，选择更准确的目的细胞群体进行分析。你觉得呢？

来源：LizaL?f,LindaArng?rden,UllaOlsson-Str?mberg,etal.FlowCytometricMeasurementofBloodCellswithBCR-ABL1FusionProteininChronicMyeloidLeukemia.ScientificReports7,Articlenumber:()

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